LAPORAN PRAKTIKUM
GENETIKA
PERCOBAAN II
ISOLASI DNA
NAMA
: NUR AFIYAH SULAIMAN
NIM
: H41113504
KELOMPOK
: V (LIMA) B
HARI/TGL. PERCOBAAN :
KAMIS/ 13 MARET 2014
ASISTEN
: RISKY NURHIKMAYANI
LABORATORIUM GENETIKA JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2014
BAB
I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
DNA (Deoxyribose
Nucleic Acid) adalah molekul utama yang mengode semua informasi yang dibutuhkan
untuk proses metabolisme dalam setiap organisme. DNA tersusun atas 3 komponen
utama yaitu gula deoksiribusa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung
membentuk nukleotida. Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan
di nukleus, mitokondria dan kloroplas (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
DNA yang menyusun
kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang terususn helix Ganda (double
helix), yang basa nitrogen dan kedua “benang” polinukleotida saling berpasangan
dalam pasangan yang tetap melali ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang
satu dengan yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam
setiap sek makhluk hidup dan disebut sebagai “cetak biru kehidupan” karena
molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang
menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Agus dan Sjafaraenan,
2014).
DNA dapat mengalami
denaturasi dan renaturasi. Selain itu, DNA juga bisa diisolasi. Isolasi DNA adalah suatu teknik dimana
hasil akhirnya strand-strand DNA dapat terpisah dalam bentuk kumpulan strand
berwujud benang-benang putih. Tujuan isolasi DNA adalah mendapatkan
ekstrak DNA pada jaringan atau sel yang diinginkan (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Isolasi DNA ini sangat
penting dalam bidang bioteknologi maupun bidang biologi molekuler. Pengenalan isolasi DNA sangat penting
mengingat bioteknologi pada akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang
biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam
tanaman seperti padi kapas dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan
keanekaragaman hayati di masa mendatang memerlukan keterampilan dan pemikiran.
Salah satunya adalah dengan mengetahui cara pengumpulan DNA dan prinsip
dasarnya sebagai pijakan untuk mempelajari biologi molekuler pada khususnya
(Agus, dan Sjafaraenan, 2014).
1.2
Tujuan Percobaan
Adapun tujuan dari
praktikum ini adalah:
1.
Untuk mengetahui cara atau metode yang
benar untuk memisahkan (mengisolasi) DNA dari buah-buahan.
2.
Mengetahui keefektifan detergen dan buah
yang dipakai untuk melakukan percobaan isolasi.
I.3
Waktu dan Tempat
Percobaan Isolasi DNA ini dilaksanakan
pada hari Kamis, 13 Maret 2014 pukul 14.00-17.00 WITA bertempat di
Laboratorium Biologi Dasar, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Hasanuddin, Makassar.
.
BAB
II
TINJAUAN
PUSTAKA
Studi
mengenai eksistensi asam nukleat pertama kali dilakukan oleh Friedrich Miescher
dari Jerman yang mengisolasi inti dari sel darah putih pada tahun 1869.
Miescher menemukan bahwa di dalam inti sel tersebut terdapat senyawa yang
mengandung fosfat yang kemudian dinamakan nuklein. Selanjutnya pada akhir abad
ke-19 telah berhasil dilakukan pemisahan antara DNA (deoxyribonucleic acid) dan RNA (ribonucleic
acid) dari protein-protein yang melekatkan molekul asam nukleat tersebut
pada sel. Pada awal tahun 1930-an, P. Levene, W. Jacobs, dan kawan-kawan
menunjukkan bahwa RNA tersusun atas satu gugus gula ribosa dan empat basa yang
mengandung nitrogen, sementara DNA tersusun atas gula yang berbeda yaitu
deoksiribosa (Yuwono, 2005).
Struktur molekul DNA
pertama kali diungkapkan oleh James Watson dan Francis Crick pada tahun 1953
berdasarkan atas foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan
Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data kimia dan fisik, Watson dan Crick
membuat model struktur DNA yang disebut untai ganda (double helix) (Yuwono,
2005).
Untai ganda DNA
tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin. Kedua rantai mempunyai
orientasi yang berlawanan (antiparalel): rantai yang satu mempunyai orientasi 5’
→ 3’, sedangkan rantai yang lain berorientasi 3’ → 5’. Kedua rantai tersebut
berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin (A) dengan thymine
(T) dan antara guanine (G) dengan cytosine (C). Ikatan antara A—T berupa
dua ikatan hidrogen, sedangkan antara G—C berupa tiga ikatan hidrogen sehingga
ikatan G—C lebih kuat. Spesfikasi pasangan basa seperti ini disebut dengan
komplementaritas (complementarity)
(Yuwono, 2005).
Kerangka gula
deoksiribosa dan fosfat yang menyusun DNA terletak di bagian luar molekul,
sedangkan basa purin dan pirimidin terletak di sebelah dalam untaian (helix). Basa-basa purin dan pirimidin
yang berpasangan terletak pada bidang datar yang sama dan tegak lurus terhadap
aksis untaian DNA. Untaian DNA mempunyai dua lekukan (groove) eksternal yaitu lekukan besar (major groove) dan lekukan kecil (minor groove). Kedua lekukan tersebut mempunyai peranan sebagai
tempat melekatnya molekul protein tertentu (Yuwono, 2005).
Ukuran molekul DNA
bervariasi antara jasad yang satu dengan lainnya. Pada jasad prokariot
variasinya tidak sebesar pada virus dan bakteriofag. Bahan genetik pada
prokariot dan virus pada umumnya berupa satu molekul tunggal DNA (kecuali virus tertentu yang bahan
genetiknya RNA). Sebaliknya, bahan genetik pada eukariot berupa beberapa
molekul kromosom yang masing-masing berupa molekul DNA berukuran besar. Ukuran
DNA pada eukariot, terutama eukariot tingkat tinggi belum diketahui secara pasti
karena kompleksitasnya (Yuwono, 2005).
Struktur
DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA
prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan
DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi
dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akanberada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi
tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan
kecepatan yang bervariasi (Kimball, 1992).
Isolasi DNA dapat
dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi sektrak sel, pemurnian
DNA dari ektrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan
dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat
memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan
polisakarida dalam konsentrasi yang dapat menghambat pemurnian DNA (Agus dan
Sjafaraenan, 2014).
Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah,
maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang
berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang
berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air renda. Semakin tinggi kadar
air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA
yang terpresipitasi juga akan sedikit (Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Proses
isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan
DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan
dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada dinding sel,
membran sel membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun
secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus
menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian
yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah detergen
(Agus dan Sjafaraenan, 2014).
Selain itu, secara kimia lisis dinding sel dapat dilakukan dengan menambahkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (ethilendiamin tetraasetat), dan SDS (sodium
dodesil sulfat). Dalam hal ini fungsi EDTA adalah sebagai perusak sel dengan cara mengikat
magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel
maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat. Adapun SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan
untuk merusak membran sel. Ini
semua menyebabkan sel menjadi lisis.
Kotoran sel yang ditimbulkan akibat perusakan oleh EDTA dan SDS
dibersihkan dengan cara sentrifugasi, sehingga yang tertinggal hanya molekul nukleotida
(DNA dan RNA). Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan
phenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan chloroform
(membersihkan
protein dan polisakarida dari larutan).
Etanol berfungsi untuk memekatkan, memisahkan DNA dari larutan dan mengendapkan DNA (Muladno, 2002).
Penambahan
detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen dapat menyebabkan
ruaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik
detergen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa “lipid protein-detergen
kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki
ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan detergen sehingga dapat
membentuk suatu ikatan kimia. Kemudian penambahan garam (NaCl) berfungsi untuk
melarutkan DNA dan setelah itu diberikan ethanol dingin 96% untuk
mengumpulkan/menggumpalkan DNA (Agus dan
Sjafaraenan, 2014).
Elektroforesis
DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat
molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain
agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA
dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro,
1998).
Molekul DNA
bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui
matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan
dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen
molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA
selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih
dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain
untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium
bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro, 1998).
Jumlah DNA dicerminkan
berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi
harus dianalisis dengan
spektrofotometer UV dengan
panjang gelombang 256 nm
(260 nm). Kualitas
DNA yang berhubungan
dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan
absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm
(Suharsono dan Widyastuti, 2006).
BAB
III
METODE PERCOBAAN
III.1 Alat
Alat
yang digunakan dalam percobaan ini adalah pisau, mesin blender, timbangan,
gelas aqua, pengaduk, penyaring (tissu / kapas / kertas saring), spatula,
tabung reaksi, pipet tetes, dan mesin vortex.
III.2 Bahan
Bahan
yang digunakan adalah buah tomat Solanum
lypersium, buah pepaya Carica papaya,
detergen Surf bubuk, detergen Rinso cair, sabun Bucream, aquades, garam
dapur, dan etanol 96% dingin.
III.3 Prosedur Kerja
Adapun langkah-langkah kerja yang dilakukan dalam percobaan ini sebagai
berikut:
1.
Melarutkan detergen (Surf, Rinso dan
Bucream) ke dalam 60 mL aquades diaduk pelan selama 15 menit.
2.
Mengambil 100 grm daging buah ditambah 100
mL aquades dimasukkan ke dalam mesin blender, kemudian diblender selama 40
detik.
3.
Mencampurkan 4 mL masing-masing larutan
sabun dengan masing-masing 4 mL jus buah.
4.
Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian
diaduk selama 10 menit sampai diperoleh campuran yang homogen serta divortex.
5.
Menyaring campuran yang dihasilkan
sebelumnya sebanyak dua kali penyaringan.
6.
6 mL hasil penyaringan tersebut kemudian
dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan menambahkan 5 mL etanol 96 % dingin.
7.
Mengamati proses timbulnya DNA, meliputi
waktu yang diperlukan, warna, serta banyak sedikitnya DNA yang terbentuk.
‘
BAB
IV
HASIL
DAN PEMBAHASAN
IV.1
Hasil Percobaan
IV.1.1 Gambar hasil Percobaan
|
Jenis buah
|
Sebelum
|
Sesudah
|
|
|
Tomat
|
Detergen Bubuk
|
|
 |
|
Detergen cair
|
|
 |
|
|
Detergen krim
|
 |
 |
|
|
Pepaya
|
Detergen Bubuk
|
 |
 |
|
Detergen cair
|
 |
 |
|
|
Detergen krim
|
 |
 |
|
IV.1.2
Tabel Pengamatan
|
No.
|
Jenis Buah
|
Perlakuan
|
Hasil Pengamatan
|
Jumlah
|
|
|
Warna
|
Waktu
|
||||
|
1
|
Tomat
Solanum
lycopersium
|
Detergen Bubuk
|
Bening, ada endapan
|
Lambat
|
++
|
|
Detergen Cair
|
Bening
|
Sedang
|
+
|
||
|
Detergen Krim
|
Putih Bening
|
Lebih Cepat
|
+++
|
||
|
2
|
Pepaya
Carica
papaya
|
Detergen Bubuk
|
Putih Kekuning-kuningan
|
Lebih Cepat
|
++++
|
|
Detergen Cair
|
Putih keruh
|
Lambat
|
+++
|
||
|
Detergen Krim
|
Putih susu
|
Sedang
|
++
|
||
IV.2
Pembahasan
Praktikum
isolasi DNA ini dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh macam buah dan
jenis deterjen terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi.
Sehingga dalam praktikum ini dibuat variabel kontrol pada jenis
detergen dan jenis buah agar dapat mengetahui buah dan jenis detergen mana yang
menghasilkan DNA paling bagus dan baik. Jenis buah yang digunakan adalah tomat Solanum lycopersicum sebagai contoh buah
yang mengandung banyak air dan pepaya Carica
papaya sebagai buah yang memiliki kandungan air tidak terlalu banyak.
Sedangkan untuk detergen yang dipakai adalah detergen bubuk merk Surf, detergen
cair merk Rinso, dan detergen krim merk BuCream.
Pada dasarnya prinsip isolasi DNA ada tiga
yaitu pelisisan sel, ekstraksi dan pemurnian. Pada praktikum kali ini
yang pertama-tama dilakukan ialah menghancurkan sampel buah dengan cara mekanik
atau pemblenderan buah untuk melisis/ merusak dinding sel. Sementara
itu dibuat pula larutan detergen dengan cara mencampurkan ketiga jenis detergen
(Surf, Rinso dan Bucream) ke dalam aquades. Pengadukan dilakukan dengan hati-hati agar tidak terjadi
banyak busa yang dapat menghalangi pengamatan.
Kemudian jus buah ditambahkan dengan larutan detergen. Penambahan
larutan detergen berfungsi untuk melisis
dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini disebabkan karena
sifat dari detergen sama dengan sifat dinding sel
yang hidrofobik, sehingga terjadi ikatan diantara keduanya dan menyebabkan
dinding sel rusak.
Lalu ditambahkan garam dapur dan diaduk. Pengisolasian DNA menggunakan garam dapur dengan tujuan untuk memekatkan
DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na+ yang dikandung oleh garam
mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA. Saat ion
Na+ garam berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan
berkumpul.
Selanjutnya
larutan disaring dengan kertas saring sebanyak dua kali penyaringan untuk memisahkan serat-serat yang kasar dengan yang halus, sehingga
didapatkan sampel berupa cairan yang tidak terlalu kental.
Hasil penyaringan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah
etanol 96 % dingin yang berfungsi membantu proses pengendapan terhadap organel-organel yang sudah keluar dari sel atau memisahkan
bagian-bagian yang terurai tersebut berdasarkan berat molekul. Ethanol berperan
dalam pengumpulan dan penggumpalan DNA karena sifatnya yang dingin.
Kemudian setelah diamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan, warna, serta banyak
sedikitnya DNA yang terbentuk. Maka hasil
yang didapatkan yaitu larutan yang paling cepat membentuk gumpalan DNA adalah
tomat+Bukrim dan tomat+Surf.
Hal ini bertolak
belakang dengan teori yang menyatakan bahwa buah pepaya akan lebih banyak
menghasilkan gumpalan DNA karena memiliki kandungan air yang lebih sedikit
daripada tomat sehingga DNA yang terpresipitasi lebih banyak pada buah pepaya.
Kenyataan ini juga
tidak sejalan dengan anggapan detergen yang paling baik digunakan untuk isolasi
DNA adalah detergen bubuk, kemudian detergen cair, lalu detergen krim. Dari
hasil tersebut maka yang dapat disimpulkan bahwa tomat dan BuCream paling
banyak menghasilkan DNA. Dan dari ketiga jenis deterjen yang
digunakan, yang paling sedikit
menghasilkan DNA adalah deterjen Rinso. Larutan dengan deterjen bubuk Surf dan Bu krim menghasilkan DNA dengan
jumlah yang cukup banyak. Namun ketiga jenis deterjen tersebut tidak dapat dibandingkan mana yang lebih baik dalam
mengisolasi DNA karena pada setiap perlakuan menunjukkan hasil yang relatif
sama.
Kemungkinan terdapat
kesalahan pada saat dilakukan pemblenderan buah pepaya yang terlalu lama dan
terlalu halus sehingga DNA yang didalamnya tercabik-cabik hancur dan
menyebabkan kegagalan pada saat pada isolasi DNA. Selain itu pada saat proses
penyaringan dan penambahan ethanol terjadi kehabisan bahan dan karenanya
terdapat sebagian percobaan yang belum tuntas dan menggunakan bahan pengganti
yang terbatas kapasitasnya dibandingkan bahan yang semestinya digunakan dalam
praktikum.
BAB
V
PENUTUP
V.1
Kesimpulan
Adapun kesimpulan dari
praktikum ini adalah:
1. Untuk
melakukan isolasi DNA metode atau teknik yang digunakan pada dasarnya ada tiga
yaitu: pelisisan sel, ekstraksi, dan pemurnian. Pelisisan dapat dilakukan
dengan cara mekanik maupun kimia, salah satunya dengan cara diblender dan
dicampur larutan detergen. Ekstraksi dapat dilakukan dengan penambahan garam
dapur (NaCl) dan pemurnian salah satu metodenya adalah dengan memberikan
larutan ethanol dingin 96%.
2. Jenis
detergen dan buah yang dipakai untuk melakukan isolasi DNA sangat berpengaruh
pada DNA yang dihasilkan.
V.2
Saran
Adapun saran untuk
praktikum ini sebaiknya alat dan bahan laboratorium ditambah untuk mencegah terjadinya
kekurangan bahan yang dapat mengakibatkan keasalahan dan kurang akuratnya hasil
yang didapatkan pada praktikum ini.
DAFTAR
PUSTAKA
Agus, Rosana dan Sjafaranain. 2014. Penuntun Praktikum Genetika. Makassar.
Dwidjoseputro.
1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta.
Kimball, J. John. 1992. Biologi. Erlangga. Jakarta.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa
Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Bogor.
Suharsono
dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan
Gen. IPB Press. Bogor.
Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar